近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術快速發展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產前篩查等。想完成這一系列檢測分析肯定離不開一間功能完備的實驗室，那么，關于二代測序實驗室裝修都應注意什么？

實驗室總體要求

NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》、《個體化醫學檢測質量保證指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術指南》、《個體化醫學檢測實驗室管理辦法》、《測序技術的個體化醫學檢測應用技術指南（試行）》進行。

1、NGS檢測人員的資質要求：NGS檢測技術人員應具備臨床病理學、分子生物學的相關專業大專以上學歷，并經過NGS技術的理論與技能培訓合格。數據分析人員應具有臨床醫學或分子生物學或遺傳學知識背景并經生物信息學培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人(醫學博士學位或高級職稱)審核。

2、NGS檢測實驗室的區域設置要求：原則上NGS實驗室應當有以下分區：樣本前處理區、試劑儲存和準備區、樣本制備區、文庫制備區、雜交捕獲區/多重PCR區域（第一擴增區）、文庫擴增區（第二擴增區）、文庫檢測與質控區、測序區、數據存貯區。各工作區空氣及人員流向需要嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。分區可根據實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應與組織樣本分開。

3、NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監督管理總局(CFDA)認可產品。涉及到實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規程（SOP），需經過臨床實驗室自建項目(LDT)驗證合格才可使用。每個NGS檢測項目在驗證時需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數進行LDT驗證。應該有經過標準品測試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數據，確定不同樣本的可信的測序深度。經驗證后，SOP發生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結果簽名留底備案。

4、NGS檢測實驗室的質量管理要求：NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息

學分析兩部分。實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內質控措施；定期參加室間質評以有及持續的質量保證和改進計劃。

NGS分析樣本、基因panel和轉運要求

NGS分析樣本類型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。

對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應首選經病理評估的組織樣本，在此數據基礎上的再次檢測可選取液體樣本動態監測。

NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質及含量，根據不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序。

不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。

未經病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。

樣本質量對檢測結果和分析至關重要，病理醫師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上，低于此標準可富集后檢測。

NGS檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理SOP指導。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環節（含冷鏈運輸）應有相關運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。

NGS檢測流程中的質量標準

1、核酸提取及其質量分析：提取的核酸質量是NGS檢測成功的關鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。

2、文庫制備及其質量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質量分析。每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。

3、NGS測序儀上機分析及其質量分析：NGS建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據檢測樣本量和質量要求確定適當的芯片，以保證測序質量和靶區覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進行測序。產生的測序數據質量參數要求詳見后文。

4、NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。（2）陽性對照：應用組合型質控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。（4）應對方案和替代方法：各個質量控制步驟中如出現異常或失敗，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質量差或有問題的區域應建立替代方法（如Sanger測序）。

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